廉瑞青1,马保华1 ;王哲民22Dy老中医
(1.山东大学医学院组织学与胚胎学教研室,济南 250012;2.山东省中医药研究所生物化学室)2Dy老中医
【摘要】 目的:探讨中药红花抗早孕过程中的生物学作用机理。方法:随机将受精后第2天的孕鼠分为3个实验组和对照组,分别经口给予不同浓度的红花液和生理盐水,连续3天,停药后24天取子宫,石蜡包埋切片,进行HE和免疫组化染色,将染色结果输入图像分析仪,观察子宫内膜的形态和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)蛋白的表达,并作定量分析。结果:实验组子宫内膜形态有异常改变;免疫组化染色表明,随着药物剂量的增多,子宫内膜细胞LIF蛋白的表达逐渐减少;但对照组呈强阳性表达。结论:中药红花作用于孕鼠子宫内膜细胞,抑制LIF蛋白的表达,从而影响胚胎着床,起到了抗早孕的作用。 2Dy老中医
【关键词】 红花;白血病抑制因子;子宫内膜;抗早孕2Dy老中医
中图分类号:R714.12 文献标识码:A 文章编号:1004-7379(2007)03-0194-032Dy老中医
The effect of Chinesedrugsaffron steep on the expression of leukemia inhibitory factor in the endometrium of implantation.Lian Ruiqing1,Ma Baohua1,Wang Zhemin2.1.Department of Histology & Embryology,Medical College of Shandong University,Jinan 250012;2.Department of Biochemistry,Shandong Traditional Chinese Medicine Research Institute2Dy老中医
【Abstract】 Objective:To study the biological mechanism of Chinesedrugsaffron during antiearly pregnancy.Method:The mated female mice were divided into three experimental groups,saffon with different concentrations were used on the 2nd day after fertilization,which lasting for 3 days,and the change of the morphology endometrium was observed.The sections were stained with HE and LIF immunohistochemistry,quantitative analysis was proformed.Result:In experimental groups,the endometrium morphology changed significantly and the expression of LIFprotein decreased gradually with the increasing of concentration,whereas the control group stable positive LIFprotein expression.Conclusion:The Chinesedrugsaffron can inhibit the expression of LIFprotein on the endometium and may have a role of antiearlypregnancy.2Dy老中医
【Key words】 Saffron;Leukemia inhibitory factor;Endometrium;Antiearly pregnancy2Dy老中医
研究证实,中药红花可使子宫内膜发生形态学改变,影响胚胎生存发育的环境,具有明显的抗早孕作用[1,2]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF) 是一种多功能细胞因子,在哺乳动物胚胎着床过程中起重要作用,LIF减少或缺失会导致胚胎着床失败,从而起到抗早孕作用。本实验主要通过免疫组化法观察中药红花对LIF蛋白表达的影响,对红花抗早孕的机理做出进一步的解释。 2Dy老中医
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1 材料与方法2Dy老中医
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1.1 材料 成熟昆明小鼠64只,由山东大学实验动物中心提供。中药红花(单方中药)由山东省中医药研究所提供。兔抗鼠LIF多克隆抗体和免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。其它试剂由济南爱博公司提供。2Dy老中医
1.2 方法2Dy老中医
1.2.1 成熟昆明小鼠,体重34±3g,喂养颗粒饲料,普通饮水。雌雄鼠合笼,次日晨查到阴栓为受精的第1天。2Dy老中医
1.2.2 随机将孕鼠分为3个实验组和对照组,每组6只。实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别按红花浸液10.5、15.5、20.5g/kg的剂量(用生理盐水稀释至1ml),经口腔给药;对照组给予生理盐水1ml。实验组和对照组分别于受精后第2天开始,每日晨8时给药,连续3天。2Dy老中医
1.2.3 小鼠停药24h后脱臼处死,取双侧子宫,4%多聚甲醛固定24h,梯度酒精脱水,石蜡包埋连续切片,切片厚度为4μm,HE染色和行免疫组化实验。2Dy老中医
1.2.4 免疫组化实验 APES处理载玻片,捞片后60℃烤片30~60min;切片常规脱蜡;3%H2O2/蒸馏水封闭20min灭活内源性过氧化酶,蒸馏水洗3×5min;0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原;5%BSA封闭液室温封闭20min;滴加一抗兔抗鼠IgG(1:100),37℃1h左右,0.01mol/L PBS洗3×5min;滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃ 20min,0.01mol/L PBS洗3×5min;滴加SABC,37℃ 20min,0.01mol/L PBS洗4×5min;DAB显色20min,蒸馏水洗2×5min;梯度酒精脱水、透明、封片,显微镜下观察LIF蛋白的表达。每组染色均设阴性对照,以0.01mol/L PBS代替一抗。2Dy老中医
1.2.5 免疫组化结果分析 由于本实验显色液为DABH2O2系统,待检物质均表达于胞质内,故光学显微镜下观察LIF蛋白阳性部分为棕黄色,根据着色深浅,将实验结果分为:强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)、极弱阳性(±)和阴性()5个等级。将免疫组化染色结果输入图像分析仪(MPIAS1000),经屏分割、滤波处理后,每组随机选6张切片,每张切片选5个不重叠的视野,分别测量子宫内膜细胞中阳性染色部位的平均光密度(OD),应用SPSS13.0软件包(单因素方差分析)对各组之间平均光密度值的差异作统计学分析。2Dy老中医
1.2.6 雌雄鼠合笼交配试验 实验动物按1:1雌雄合笼行交配实验,观察实验组和对照组动物合笼交配、生育情况(各组均在孕2天起,每日晨8时给药或生理盐水,连续3天)及停药后再孕能力的恢复情况(停药后观察交配受孕情况,第6天开始统计)。2Dy老中医
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2 结 果2Dy老中医
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2.1 石蜡切片HE染色观察 实验组Ⅲ子宫内膜充血,上皮细胞排列紊乱,见图1;对照组孕鼠子宫内膜和上皮细胞正常,见图2。2Dy老中医
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2.2 免疫组化染色 LIF蛋白主要在孕鼠子宫内膜的腔上皮和腺上皮细胞胞浆内表达,部分内膜基质细胞的胞浆也有弱阳性表达,且腔上皮>腺上皮>基质细胞。LIF蛋白在腔上皮主要表达于胞浆的游离面,在腺上皮胞浆内则均匀表达,图像分析结果表明,各组之间有统计学差异,且随着药物浓度的增加,LIF蛋白的表达显著降低,见图3。2Dy老中医
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实验组Ⅰ,孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白呈阳性(++)表达,见图4。实验组Ⅱ,孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白呈弱阳性(+)表达,见图5。实验组Ⅲ,孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白呈极弱阳性(±)表达,见图6。对照组,孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白实验结果呈强阳性(+++)表达,见图7。2Dy老中医
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2.3 雌雄鼠合笼交配试验结果 实验组和生理盐水组之间的生育抑制情况,见表1,停药后恢复生育情况,见表2,差异有统计学意义(P<0.05)。由表2可见给药浓度越小,停药后生育能力恢复越快,反之越迟;各组在停药后第10天生育能力均恢复,表明红花的抗早孕作用是可逆的。2Dy老中医
表1 给药后生育抑制情况2Dy老中医
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表2 停药后生育恢复情况2Dy老中医
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3 讨 论2Dy老中医
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中医理论认为,红花的抗早孕作用是通过”活血通经、散结通络”实现的。现代药理实验证实,红花的主要活性成分有红花甙、新红花甙、红花醌甙以及红花多糖、棕榈酸、肉桂酸、月桂酸等成分[3]。尽管红花具有抗早孕作用已被研究证实[1,2],但其抗早孕的机理尚不清楚。1969年Stewart等最早发现了一类能诱导M1期白血病细胞系分化为正常细胞的因子[4],该因子具有抑制鼠骨髓白血病细胞系M1的增殖,促进其分化的作用,所以命名为白血病抑制因子LIF。以后的研究表明,LIF在调节胚胎着床过程中具有重要作用,LIF表达减少或缺失将导致不孕。文献报道,胚胎植入受多种因素的精确调节[5],而白血病抑制因子LIF维持着植入期子宫内膜和胚胎发育的动态平衡,在维持胚胎植入中起重要作用,LIF蛋白在早孕小鼠子宫内膜中的表达远高于全身其他器官[6];从小鼠受孕第1天起LIF的表达量逐渐增多,到第4天时最多[7],此后的整个孕期内都有表达。Ptak等[8]的研究表明,白血病抑制因子可以通过影响原始卵泡,提高绵羊的体外受精率。LIF蛋白表达减少或缺失时,受精卵能够维持早期的发育,但是到达子宫的胚胎不能够着床,从而导致流产和不孕[9]。 Sengupta等[10]的研究表明,应用单克隆抗LIF抗体后,能够有效抑制猴胚泡的植入。2Dy老中医
本实验形成了红花抗早孕动物模型,经常规消化道途径给药,结果表明,对照组孕鼠子宫内膜LIF蛋白呈强阳性表达,实验组表达呈现不同程度的抑制,抑制程度随给药浓度增加而增大。本实验采用雌雄鼠1:1合笼交配实验,实验组和生理盐水组之间的抗生育情况和停药后恢复生育情况都有明显差异。2Dy老中医
参 考 文 献2Dy老中医
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第一作者简介:廉瑞青(1980),女,山东大学医学院组织胚胎学教研室,硕士研究生。主要研究方向:实验胚胎学。2Dy老中医
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